离子色谱法在中药化学成分分析中的应用进展
发布时间：2023-03-21作者：小编来源：点击：次
离子色谱(ion chromatography, IC)是基于离子性化合物与固定相表面离子性功能基团之间的电荷相互作用，从而实现离子性物质分离和分析的色谱方法，最初常用于测定样品中的阴阳离子，后来发展到测定样品中的糖类、有机酸碱、氨基酸等，是一种新型高效液相色谱技术[1]. IC法简单快速、灵敏度高、选择性好、能同时分析多种离子化合物，其分离模式分为离子交换色谱(HPIC)、离子排斥色谱(HPIEC)和离子对色谱(MPIC). HPIC应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子，这在离子色谱中应用最广泛，适用于中药中阴阳离子的分析. HPIEC的分离机理主要是离子排斥，分离介质与化合物间被假定存在一层Donnan膜，强酸电解质向填料渗透时被膜排斥，而弱酸电解质可穿透膜进入填料，因此产生了色谱保留，适用于中药中有机酸、无机弱酸及醇类的分析. MPIC是基于待测组分在分析柱上的吸附作用不同的原理进行分离，适用于具有表面活性的阴阳离子和金属配合物的分析[2,3,4].
近年来，IC法在中药分析中的应用主要包括金属离子、无机阴离子、有机酸类、糖类等成分的检测. 本文综述了近年来国内外离子色谱技术在中药化学成分分离分析中的应用进展，以期为中药分析工作提供借鉴.
1 IC法在中药金属离子分析中的研究进展
中药中的金属元素主要为碱金属、碱土金属、重金属以及过渡金属离子等，这些金属元素对中药中多种生物分子的活性起到关键调控作用，例如酶的催化活性、蛋白质的合成及功能稳定、神经传导、肌肉运动和营养物质的代谢[5].
中药中的金属离子分析主要采用阳离子交换色谱柱分离、抑制电导法检测[6]. 程益清等[7]使用IonPac AS11-HC色谱柱和IonPac CS12A色谱柱同时测定瓜蒌皮注射液中Cl-、Na+和NH+4的含量，所用淋洗液为20 mmol/L甲磺酸溶液，流速0.8 mL/min. 结果表明，不同批次瓜蒌皮注射液中Cl-、Na+和NH+4的质量分别为每支9.764～13.288 mg、3.772～5.616 mg和2.880～4.740 mg. Cl-含量超标会引起人体渗透压的增大，造成溶血和细胞萎缩. Na+含量过高或过低可使脑细胞脱水或水肿. 与传统方法(氧化还原法、电位滴定法等)相比，此方法快速、简便、专属、灵敏，平均回收率分别在98.2%～99.9%之间，为中药注射剂提供了一种较为新颖的质量控制手段. 翟武等[8]使用IonPac CS12A色谱柱，测定丹参中碱金属和碱土金属的含量，甲烷磺酸淋洗液浓度为20 mmol/L,流速1.0 mL/min. 试验结果表明，生药丹参中基本不含Li+,但K+的含量较高，其质量分数为3.82～6.92 mg/g. 其次为Mg2+和Ca2+,质量分数分别为0.62～1.13 mg/g和0.44～0.64 mg/g. 采用IC法测定中药材中碱金属和碱土金属的含量，测定结果准确、灵敏，操作简单、适用性强. 刘玉芬等[9]使用IonPAC CS 12A色谱柱，测定了中药女贞子中碱金属和碱土金属的含量，淋洗液为11.0 mmol/L硫酸溶液，流速为1.00 mL/min, 测得Na+、K+、Mg2+、Ca2+的质量分数分别为0.4、14.66、2.39、1.75 mg/g, 4种离子的回收率在98.3%～103.1%之间. 从分析结果看，女贞子浸煮液中K+的含量较高，Na+的含量较低，与原子光谱法相比较，此方法操作简便，不需要预处理，便于测定中药中金属离子的含量. 丁海萍等[10]使用IonPAC CS 12A色谱柱测定了不同产地萹蓄中金属元素含量，所用淋洗液为20 mmol/L甲磺酸溶液，流速为1 mL/min, 测得萹蓄中K、Mg、Ca的质量分数分别为15.50、23.80、51.28 mg/g. 萹蓄中高含量的K元素起到利尿作用，Mg元素含量高可以抑制肿瘤的发生与生长、有降低血糖和尿糖的作用，Ca元素有控制新陈代谢、激素分泌、细胞黏附和分裂等生理活动的作用. 此法精密度好、准确度高、加标回收率结果满意，各元素回收率分别在92.14%～106.92%,94.02%～108.43%,可以应用于中药中多种元素含量分析. 采用IC法分析中药中的金属离子具有很强的可行性与准确性，方法操作简便、分析快速、干扰小、灵敏度高，是测定中药材中常见离子的一种有效的方法，更有便于研究中药中金属离子的含量对疗效的影响.
2 IC法在中药二氧化硫残留分析中的研究进展
中药饮片在加工和流通贮存过程中，硫磺熏蒸或浸泡是中药饮片漂白、保湿、防虫的传统加工方法之一[11]. 但近年来中药材的硫磺熏蒸滥用现象已对用药安全造成了严重影响，过量二氧化硫会对人体的心血管系统、血液系统、肺组织、生殖系统等产生不同程度的损伤[12]. 因此，测定中药材中因硫磺熏蒸或浸泡而产生的亚硫酸盐残留量对于保证中药材质量和用药安全具有非常重要的意义.
目前，国家标准GB 2760—2014检测中药材及饮片中亚硫酸盐残留量(以二氧化硫计)的限量为不得超过100 mg/kg[13]. 中华人民共和国药典2020版检测中药材及饮片中亚硫酸盐残留量(以二氧化硫计)的限量为不得超过150 mg/kg[14]. 常规方法耗时、选择性差、测定过程中使用的乙酸铅对实验室环境造成污染，并对实验人员造成潜在的危害. 李梅花等[15]比较了酸碱滴定、IC法测定中药制剂中的二氧化硫残留量的适用性及结果. 离子色谱条件为使用Thermo Scientific阴离子色谱柱，0.010 74 mol/L氢氧化钠滴定液为淋洗液，1.0 mL/min流速，测得平均回收率为83.09%,相对标准偏差(RSD)为2.53%. 酸碱滴定法测定的结果高于离子色谱法. IC法灵敏度、精密度、准确性高，适用于验证方法. 酸碱滴定法由于其自身方法的限制，重复性偏差较大，滴定结果误差较大，样品组分多样，其中一些挥发性酸对结果有很大影响，更加适用于中药制剂中二氧化硫残留量的初筛. 王欣美等[16]使用IonPac AS11-HC型离子交换柱测定甘草、制天南星和金银花等多种中药中二氧化硫残留量，所用淋洗液为15 mmol/L KOH,流速为1.0 mL/min, 测得3种中药中二氧化硫残留量分别为93.1、162.0、129.9 mg/kg, 检测限为0.53 mg/kg, 平均回收率为103.7%. 传统方法(碘量法和碱量法)需专门制作全玻璃蒸馏装置，且取样量大(10 g以上),蒸馏时间长(1 h以上),误差较大，准确性不高. 而IC法测定中药中二氧化硫的方法取样量少(2 g以内),耗时短(30 min以内),采用仪器方法进行前处理和检测，具有可控性和专属性强、误差小、灵敏度和准确度高的优点. 滕南雁等[17]使用IonPac AS11-HC色谱柱测定中药西瓜霜硫酸盐的含量，以30 mmol/L氢氧化钠为淋洗液，流速为1.0 mL/min, 测得硫酸盐的含量在89.99%～91.67%之间. 传统的硫酸钡重量法操作复杂，耗时长，采用离子色谱测定硫酸根，操作简便，灵敏度和准确度高，平均加样回收率达到99.9%,可对含硫酸盐的中药材及其制剂的检测提供高效率的方法. IC法在测定中药材及其制剂的二氧化硫残留时具有灵敏度高、操作简便、重现性好等优点，近年来已被广泛使用. 目前IC法是测定二氧化硫残留量较好的方法，可准确测定当归等中药材中二氧化硫的残留量，为制定相关的残留量国家标准提供数据支持[18].
3 IC在中药无机阴离子分析中的研究进展
中药含有卤素、氮、磷、硫等无机阴离子. 在中药中，虽然无机阴离子不常作为有效成分使用， 但对中成药和药材中无机阴离子的分析可以作为全面检验产品质量的参考. 与无机阴离子的经典分析方法(容量法和重量法)相比，离子色谱-电导检测法具有操作简便、准确度和灵敏度高、可同时分析多种无机阴离子等优点. 容量法和重量法耗时长、灵敏度低、且易受干扰[19]. 鲁广秋[20]等建立一种超声波辅助提取-离子色谱法测定臭灵丹中4种阴离子的方法，通过对提取方法、溶剂种类和用量、温度和时间的比较，确定的最佳预处理方法为40 mL水作提取溶剂、提取时间30 min、提取温度25 ℃,采用Ion Pac AS22阴离子色谱柱测定4种阴离子平均含量，测得SO2−4、PO3−4、Cl-、NO-3的质量分数分别为6.805、6.561、5.986、1.354 mg/g. 该方法快速、经济、有效、准确度高，4种阴离子的回收率大于97%,RSD小于3%,能够满足阴离子分析的要求. 符继红等[21]使用Ion Pac AS22阴离子色谱柱分离氯化物、亚硝酸盐、溴化物、硝酸盐和硫酸盐，考察了邻苯二甲酸氢钾和苯甲酸钠、邻苯二甲酸和三羟甲基氨基甲烷两种淋洗液对麻黄中各种阴离子的洗脱效果，比较后选择了流动相为邻苯二甲酸和三羟甲基氨基甲烷的混合溶液，流速为1.0 mL/min, 测得回收率为96.6%～100.4%,6种离子的RSD在0.37%～1.92%之间. IC法是分析中药中无机阴离子的常用方法，准确度高、灵敏度高、线性关系良好、简便实用. Zhang等[22]使用IonPac AS18色谱柱测定漱口药中氟化物、氯化物、硫酸盐、磷酸盐、单氟磷酸钠、甘油、山梨酸钾及糖精钠，淋洗液为梯度浓度的氢氧化钾，流速为0.25 mL/min. IC法显著减少了水浸引起的干扰问题，检测更灵敏，阴离子的背景电导率较低，采用梯度淋洗液可以同时分离和确定弱和强保留阴离子，试验中采用可吸附阴离子交换基团的高度交联乳胶微粒填充色谱柱，提高了分析无机阴离子的选择性. 王宇等[23]采用IonPac阴离子分析柱同时测定利咽灵片中9种无机阴离子的含量，淋洗液浓度条件为氢氧化钾溶液梯度：0～22 min, 8～35 mmol/L,淋洗液流速为1.0 mL/min, 9种无机阴离子的平均加样回收率在102%～104%之间，RSD在2.23%～4.99%之间. IonPac阴离子分析柱是一种具有烷醇季铵功能基团的中高亲水性色谱柱，可高效分离低浓度有机酸及阴离子的分离. OH-能够分离与树脂亲和能力不同的阴离子，使基线平稳，精密度高，重复性好.
4 IC法在中药有机酸分析中的研究进展
中药中的有机酸具有广泛的生物活性，如羌活中十四烷酸甲酯具有镇痛作用[24],半夏中丁二酸具有止咳平喘的作用[25],草果中原儿茶酸具有抑菌作用[26],大青叶中的邻氨基苯甲酸等有机酸具有抗内毒素、抗炎、抗氧化等作用[27],当归中阿魏酸可用于心血管和血液系统疾病的治疗等[28]. 常用的有机酸分析方法有高效液相色谱法、气相色谱法和IC法等. 但中药中有机酸在高效液相色谱中保留较弱，气相色谱法需要衍生化，而IC法在操作简便的同时，中药材中的有机酸类物质也能够保留[29]. 王娜妮等[30]使用超声辅助离子色谱法，IonPac AS11-HC 分析柱分析析木瓜、女贞子、金银花等5种中药饮片中有机酸含量，淋洗液为梯度的KOH溶液，柱温为30 ℃,5种有机酸能得到很好的分离，RSD低于0.43%,测得木瓜和金银花中有机酸种类较多. 此法所用的梯度淋洗液浓度能使5种有机酸全部分离，具有分离效果好、稳定性佳、含量测定准确的优点. 李桂镇等[31]采用固相萃取-电导抑制离子色谱法，Ionpac AS11分析柱测定了金丝梅和萝芙木中常见有机酸，淋洗液为7.5 mmol/L NaOH溶液，流速为0.7 mL/min. 金丝梅样品中未检测到氯乙酸和NO-2,SO2−4和Cl-含量较高，萝芙木中草酸含量比金丝梅中的稍高. 相比于测定有机酸的其他方法，如高效液相色谱法、气相色谱法等，IC法简单，分离效果良好，准确度高，样品回收率在83.0%～100.8%之间，RSD低于5%,适用于中草药中常见有机酸含量的测定. 刘静等[32]建立能够了同时测定注射用丹参中乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸和草酸含量的IC法，以IonPac AS11-HC阴离子交换柱分离，1～50 mmol/L氢氧化钾溶液梯度淋洗. IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱是中高亲水性色谱柱，对有机酸分离能力良好，重复性好，平均回收率分别在92.4%～105.1%之间. 试验结果表明，IC法快速准确、简便实用、重现性好、灵敏度高，适用于中药中有机酸的定量检测.
5 IC在中药糖类物质分析中的研究进展
糖类是自然界广泛存在的重要的有机化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等多种生物活性. 由于糖类物质的紫外吸收十分微弱，直接采用紫外检测器-HPLC法测定糖类成分，灵敏度较低[33]. 示差检测器-HPLC法虽然可以解决糖类成分紫外吸收弱，导致灵敏度较低的问题，但该方法检测限较低[34]. 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法具有操作简便、准确度和灵敏度高、无需衍生等优点，目前，一般采用该类方法对糖类含量进行分析[35].
5. 1 中药单糖分析
李艺等[36]使用Dionex CarboPac PA200分析柱分离测定糊精中的还原糖，以纯化水为流动相A,0.25 mol/L NaOH溶液为流动相B,0.25 mol/L醋酸钠溶液为流动相C,流速为0.4 mL/min. 该方法样品制备简单，灵敏度和准确度高，所测成分之间的分离度好，平均回收率分别为98.4%、99.2%、100.9%、98.9%、99.1%. 传统重量法影响结果的因素较多，如煮沸反应时间、过滤、洗涤、干燥等步骤都可能对结果造成影响，而IC法简单快速且专属性较高，排除了人为操作对结果的影响. Cataldi等[37]使用CarboPac PA1分析柱检测乳制品中的单糖与双糖含量，碱性淋洗液在使用前，用氦气冲洗约20 min, 将用于洗脱剂制备的纯水脱气，加入适量标记的无碳酸50% NaOH,将洗脱液保存在塑料容器中，并用Dionex洗脱组织剂(EO1)使其饱和，使CO2吸附量最小化，流速为1.0 mL/min, 所采用的洗脱液组成可以为所选样品提供最佳分离，而不受基质组分的干扰. Xu等[38]采用高效阴离子交换色谱与电喷雾电离质谱相结合法，CarboPacPA1分析柱对果胶中的单糖进行分析，单碳水合物分析使用10 mmol/L NaOH溶液(0～25 min)作为淋洗液，二碳水合物分析使用100 mmol/L NaOH(25～45 min)作为淋洗液，流速为0.30 mL/min, 柱子的流出液中加入含有机溶剂的鞘液，可以提高电喷雾电离质谱对糖的灵敏度.
5. 2 中药寡糖分析
寡糖具有调节肠道菌群、增强造血功能、抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤、抗炎菌、抗病毒、降血糖和免疫增强等多种药理、生理活性. 熊建飞等[39]建立阴离子交换色谱-脉冲安培检测法，采用METROSEP CARB 1阴离子交换柱测定了玄参中水苏糖的含量，淋洗液为30 mmol/L NaOH,流速为1.0 mL/min, 峰面积的RSD为0.56%～9.01%,加标回收率在96.52%～109.56%之间. 该方法预处理简单，准确度高，适用于快速测定中药中的低聚寡糖.
5. 3 中药多糖分析
中药多糖具有抗肿瘤、增强免疫、调节肠道微环境、抗氧化等作用，建立含有多糖类成分的中药分析方法，是中药现代化质量控制水平提高的有效措施[40]. 乐胜锋等[41]采用水提醇沉法提取芦荟鲜叶中的多糖，经三氟乙酸水解，利用Dionex CarboPac PA10高效阴离子色谱柱色谱柱分离，氢氧化钠梯度淋洗，流速为1.0 mL/min, 建立了芦荟多糖中岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖7种常见单糖的测定方法，加标回收率为97.5%～102.5%,实现了芦荟多糖中7种单糖的分离和定量分析. IC法无需进行衍生化操作，简单且灵敏度高，为单糖的定性定量分析及多糖的单糖组成分析提供了一种快速可靠的方法. Xie等[42]采用Carbo PACTM PA10分析柱测定青钱柳多糖中的单糖组成，淋洗液为12.5 mmol/L NaOH,流速为0.25 mL/min. 试验结果表明，青钱柳多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成，物质的量之比为1.00∶1.85∶3.26∶3.12∶0.85∶0.29,建立的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)法简单、快速、灵敏. 该方法的最大优点是不需要标记分析物进行检测，极大简化了样品清理过程，缩短了总分析时间，样品不需要衍生化且运行时间仅20 min. 经验证该方法具有良好的线性(R2为0.998 7～0.999 9),精确度高(RSD<3.8%)、灵敏度高(2.57～7.86 nmol/L). 试验结果表明所建立的方法非常适合于多糖的测定，也可用于同时测定其他单糖组成的多糖测定. 何连军等[43]采用超声辅助水浴提取多花黄精粗多糖，经硫酸水解后，采用CarboPac PA1色谱柱测定其多糖中单糖的组成，采用梯度洗脱，淋洗液为250 mmol/L NaOH溶液，流速为1.0 mL/min, 经验证该方法的加样回收率为88.36%～111.3%,测得各单糖在1～100 mg/L线性关系良好(r>0.999),最低检出限为0.015～0.025 mg/L,RSD为1.35%～2.80%. 试验建立的HPAEC-PAD法不需将糖衍生化，操作简便，分离效果好，灵敏度高，可用于多花黄精中多糖的单糖组成的分析.
6 总结
IC在中药化学成分分析的应用如表1所列. 从现有的文献可以看出，目前IC法主要应用于中药中金属离子、无机阴离子、有机酸和糖类成分的研究.
表1 IC在化学成分分析中的应用 导出到EXCEL
| 来源 | 化学成分 | 色谱柱类型 | 参考文献 |
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瓜蒌皮注射液 |
Cl-、Na+、NH+4 | IonPac AS11-HC、IonPac CS12A | [7] |
|
丹参 |
Li+、K+、Mg2+、Ca2+ | IonPac CS12A | [8] |
|
女贞子 |
Na+、K+、Mg2+、Ca2+ | IonPac CS12A | [9] |
|
萹蓄 |
K+、Mg2+、Ca2+ | IonPac CS12A | [10] |
|
40批中药制剂 |
SO2/SO | Thermo Scientific | [15] |
|
甘草、制天南星和 金银花等 |
SO2/SO | IonPac AS11-HC | [16] |
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西瓜霜 |
SO2/SO | IonPac AS11-HC | [17] |
|
臭灵丹 |
SO、PO、Cl-、NO-3 | Ion Pac AS22 | [20] |
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麻黄 |
SO、Br-、Cl-、NO-2 | Ion Pac AS22 | [21] |
|
漱口药 |
F-、Cl-、SO、PO、单氟磷酸钠、 甘油、山梨酸钾及糖精钠 |
Ion Pac AS18 | [22] |
|
利咽灵片 |
F-、HCOO-、Cl-、NO-2、Br-、NO-3、 SO、C2O和PO |
Ion Pac | [23] |
[23]
续表1 导出到EXCEL
来源 化学成分 色谱柱类型 参考文献
|
来源 |
化学成分 | 色谱柱类型 | 参考文献 |
|
木瓜、女贞子、金银花、 覆盆子、山茱萸 |
乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、 酒石酸、草酸、富马酸 |
IonPac AS11-HC | [30] |
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金丝梅、萝芙木 |
NO-2、SO、C2O、Cl- | IonPac AS11 | [31] |
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注射用丹参 |
乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、草酸 | IonPac AS11-HC | [32] |
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糊精 |
葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖 | Dionex CarboPac PA200 | [36] |
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乳制品 |
乳糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖 | CarboPac PA1 | [37] |
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果胶 |
葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、 阿拉伯糖、木糖 | CarboPac PA1 | [38] |
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玄参 |
水苏糖 | METROSEP CARB 1 | [39] |
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芦荟 |
岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖 | Dionex CarboPac PA10 | [41] |
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青钱柳 |
鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖 | Carbo PACTM PA10 | [42] |
|
花黄精 |
鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖 | CarboPac PA1 | [43] |
基于中药基质的复杂性，近年来离子色谱技术在中药分析中的应用愈加广泛. 与传统分析方法相比，离子色谱技术在中药金属离子、无机阴离子、有机酸、糖类等成分的分离分析中表现出独特的优势. 展望未来，预期离子色谱技术的重要发展方向：一是离子色谱-质谱联用技术将成为中药分离分析和结构鉴定应用与研究中的重要方法. 二是新型离子色谱柱的研究将为离子色谱更广泛的应用提供支撑. 三是离子色谱技术在中药学方面的研究将会受到重视.
