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现代分析仪器在药品检验中的应用

发布时间:2021-03-25作者:lht来源:未知点击:

 
 
2018年1月30日国家药典委员会发布了《中国药典》2020年版编制大纲,大纲以建立“最严谨的标准”为指导,鼓励药品质量控制技术创新、检测方法创新、生产工艺创新,推进先进检测技术在药品质量控制中得到转化和应用[1],《中国药典》2020年版也将于2020年12月30日正式实施。随着现代分析仪器的迅猛发展,一些新技术、新方法被《中国药典》收载,特别是光谱、色谱、质谱以及色谱-质谱联用等技术的不断发展,在药品检验中的应用越来越广泛,涉及含量测定、有关物质、杂质检查等多个检验项目。新技术的普遍应用大大促进了药品质量控制技术的提高,使我国药品检验水平与国际接轨。本文根据《中国药典》2010年版颁布以来近10年的文献,探讨现代分析仪器及其技术在药品检验中的应用和药品安全的发展方向。
1 光谱分析技术
 
光谱分析法按不同的分类可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法,或分为原子光谱法和分子光谱法。原子光谱常见的有原子吸收分光光度法(AAS)、原子荧光光度法(AFS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES);分子光谱又可分为分子吸收光谱和分子发光光谱,分子吸收光谱主要有紫外-可见分光光度法(UV-VIS)、红外光谱法(IR),分子发光光谱主要有荧光分光光度法、火焰光度法。
1.1原子吸收分光光度法(AAS)
 
AAS在药品质量控制中主要用于金属元素的含量测定[2]。在《中国药典》中主要用于中药材的铅、镉、砷、汞、铜以及空心胶囊中铬的测定。随着技术的不断改进与提高,AAS目前已能测定70多种金属及类金属元素,因其具备灵敏度高、选择性好、操作简便快速等优点,已成为药品检验的重要工具之一。但是AAS测定砷、汞需要有丰富的操作经验,否则灵敏度达不到,或者氢化物发生装置管路污染,特别是高浓度的冷汞蒸气难以清除。
1.2原子荧光光度法(AFS)
 
AFS是我国有代表性的具有自主知识产权的现代分析仪器,普遍被用于食品、药品、化妆品、环境等领域的金属元素检测[3-6]。经过多年发展,AFS已能检测10多种金属元素,往往与AAS互为补充。其原理是被测样品与还原剂发生氢化反应从而得到被测元素的氢化物气体,进而得到被测元素的基态原子,常被用于中药材中砷、汞重金属的测定,其优点是灵敏度高、专属性强、抗污染能力较好。在应对砷、汞形态分析方面,国内多家公司推出了LC-AFS联用仪,可用于含有雄黄、朱砂等矿物类中成药或中药材的检测[7-8],是液相色谱法-电感耦合等离子体质谱法(LC-ICP-MS)的重要补充。虽然AFS未被《中国药典》收载,但是在2020年版征求意见稿“元素杂质限度和测定指导原则”的文末指出“如使用《中国药典》四部通则中收载之外的其他测定方法,应在品种项下详细描述”,遗憾的是该指导原则最终没收载在《中国药典》2020年版。AFS已经非常成熟,在基层药检机构、药厂也可配备,建议国家药典委员会在重金属元素及其形态分析中增加收载AFS,以《中国药典》为桥梁,推出中国标准,助力国产仪器国际化。
1.3电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)与电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)
 
ICP-AES和ICP-MS都可以用于多元素分析,其原理都是样品雾化后以气溶胶形式进入等离子体中心区,原子化、电离、激发或转化成带正电荷的正离子,被相应的检测器检测到特征谱线或质荷比,从而进行定性、定量。但在《中国药典》2020年版中无论是“通则2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法”还是“通则9304 中药中铝、铬、铁、钡元素测定指导原则”,都没有将ICP-AES列为标准方法,ICP-MS仍然是首选方法。ICP-MS发展到今日,高度自动化使其更便于操作,虽然价格较AAS、ICP-AES更贵,但高通量的多元素检测使得单批次的每个元素检测费用并不高,而且比AAS、ICP-AES更低的检出限更加受到分析人员的青睐。此外,高效液相色谱法-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)用于砷、汞的形态分析[9-11],是《中国药典》2020年版“通则2322 汞、砷元素形态及价态测定法”收载的唯一方法。可见ICP-MS作为药品质量控制特别是中药材的多元素检测应用更具优势、前景更广阔。
1.4紫外-可见分光光度法(UV-VIS)
 
由于许多化学药、中药成分结构中具有吸收紫外光或可见光的基团,或这些基团能与某些试剂、离子等发生颜色反应,从而很容易被检测,作为经典的仪器分析方法,UV-VIS在药品检验中还被广泛地用于药品的性状、鉴别、检查和含量测定等。UV-VIS仪器时至今日的发展,本质上没有太大的改变,但是随着光学设计及计算机软件的发展,除了作为液相色谱仪的常规检测器外,还在溶出仪上开发出了原位光纤实时测定技术[12],《中国药典》2015年版和2020年版“通则0931溶出度与释放度测定法”都引入了该技术,用于药物溶出曲线和缓释制剂溶出度的测定。
1.5拉曼光谱法(Raman spectra)
 
拉曼光谱法因其快速、准确,测量时不破坏样品,几乎不需要样品制备等特点,常被用于化学鉴别、结构分析、固体性质检测,也可用于假药检测和质量控制。近年来,拉曼光谱法及近红外分光光度法在中成药、保健食品非法添加违禁药物的研究应用很多[13],可作为一种快捷、方便、准确的快筛技术。
1.6近红外分光光度法 (NIR)
 
NIR是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术,随着新的光谱理论和新方法不断建立、化学统计学的深入研究和使用,促进了NIR分析技术的快速发展。NIR有样品无需前处理、分析速度快和便于在线分析等特点。周天祥等[14]利用NIR开发了鉴定中成药中异性有机物的方法。
2 色谱分析技术
 
色谱法是综合的鉴别手段,该方法简便、快速,已成为药品检验最重要的方法之一。20世纪50年代气相色谱法兴起,把色谱法提高到分离与在线分析的新水平,奠定了现代色谱法的基础。十几年后,高效液相色谱法迅速发展,为难挥发、热不稳定及高分子试样的分析提供了有力手段,大大拓展了色谱法的应用范围。经过一个世纪的发展,色谱法的许多理论、技术和方法趋于成熟,在药品检验中的应用越来越广泛。
2.1 薄层色谱法(TLC)
 
TLC是较早应用于药品检验的一种重要技术,由于操作简便、色谱结果直观、显色方法可选性大,兼具分离鉴定双重功能,故广泛应用于药品检验的鉴别和检查项目,其仪器化主要有自动薄层色谱点样仪、自动薄层色谱成像系统以及薄层色谱扫描仪等。在定量方面因其定量准确度差、分离效果受影响因素多、定量限高等缺点,在《中国药典》2015年版中除枸杞子中的甜菜碱等少量项目还在用薄层色谱扫描仪进行含量测定外,大部分品种逐渐被高效液相色谱仪代替薄层色谱扫描仪用于含量测定,《中国药典》2020年版已将枸杞子的甜菜碱含量测定改为了高效液相色谱法。
2.2 气相色谱法(GC)
 
GC是以气体为流动相的柱色谱法,由于气体黏度小、组分扩散速率高、传质快、可供选择的固定液种类比较多,故具有选择性好、柱效高、灵敏度高的特点。在药品检验中主要用于药品挥发性成分、溶剂残留量、中药挥发油、农药残留量等方面的检验[15],根据不同的成分性质可选择氢火焰离子化检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)、氮磷检测器(NPD)、电子捕获检测器(ECD)、热导检测器(TCD)等检测器,进样方式主要有直接进样和顶空进样,色谱柱目前主流的是熔融石英毛细管柱,玻璃或不锈钢填充柱已经很少被使用。
2.3高效液相色谱法(HPLC)
 
HPLC是以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的色谱分离技术。HPLC对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了GC的不足,在《中国药典》中使用HPLC进行含量测定的品种每一版都较前一版有较大幅度的增加,已经成为药品检验中最常用的现代仪器分析技术。根据不同的化合物特性可配置不同的检测器,最常用的为紫外-可见分光检测器(UV-VIS),包括二极管阵列检测器(DAD),其他常见的有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。在《中国药典》2020年版“通则0512 高效液相色谱法”中增加了通用型检测器——电雾式检测器(CAD,也叫电喷雾检测器),CAD以较高的灵敏度、低检测限、较强的通用性等突出的优势,广泛应用于检测不挥发性或半挥发性物质,尤其适用于皂苷类、糖类、生物碱类、脂类化合物等无紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析与检测[16]。在定性分析方面,除了传统的利用保留时间定性,《中国药典》2020年版增加了利用光谱相似度和利用质谱检测器提供的质谱信息定性。此外,随着多维液相色谱技术在中成药分析领域的应用越来越广泛[17-23],《中国药典》2020年版首次引入了多维液相色谱法,用于难分离的混合物质的分析。
 
2004年沃特世公司的超高效液相色谱仪(UPLCTM)面世,使用粒径小于2μm,柱径为2.1mm的色谱柱,系统耐受压力大于1000bar,使得HPLC的发展进入了一个全新的时代,各个仪器厂家纷纷推出自家的超高效液相色谱仪(UHPLC)。《中国药典》2010年版首次收载了UHPLC,成为测定复方丹参滴丸中丹参素的法定检测方法。《中国药典》2015年版增加了护肝丸(胶囊、颗粒)等制剂中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的UHPLC方法测定,但是由于采用UHPLC方法的品种太少,业界对UHPLC的系统稳定性和合规性还存在着一定的担忧。高青等[24]介绍了UHPLC与HPLC之间的方法转换及验证,认为HPLC转换成UHPLC只需验证分离度和灵敏度,其他系统适应性指标无需验证,而且仪器厂家都推出有方便快捷的方法转换软件,可以很方便地将标准方法条件转换成UHPLC条件,从而大大缩短了分析时间和减少流动相溶剂使用量。以多种皂苷类成分分析为例[25-26],HPLC分析时间大于60分钟,UHPLC分析时间小于15分钟,但是含量测定的结果无显著性差异。《中国药典》2020年版对使用小粒径(约2μm)填充剂和小内径(约2.1mm)色谱柱时需要调整的参数给出了明确的调整范围,说明业界已经认可UHPLC作为一个成熟的技术应用于药品检验领域,UHPLC技术正式引入《中国药典》。
2.4 离子色谱法(IC)
 
IC被广泛用于有机酸、阴阳离子、氨基酸、抗生素、蛋白质等物质的分析[27-28],其主要分离机制是离子交换,常用的检测器为电导检测器、安培检测器和紫外检测器,还可以和ICP-MS或质谱联用。IC被《中国药典》2010年版首次收载,用于帕米膦酸二钠等4个品种的含量测定、有关物质、杂质检查。在《中国药典》2015年版中又用于中药材二氧化硫残留量的测定,成为液相色谱技术的一个重要补充。
3 质谱及其联用技术
 
质谱法被《中国药典》2010年版二部首次收载,因其可提供化合物的分子量和结构信息,极高的灵敏度,以及有丰富的样品引入联用接口,集合了色谱技术优异的分离效能和质谱超高灵敏度的色谱-质谱联用技术得到迅猛发展,再加上新的离子源技术和质量分析器被成功开发,质谱成为药物分析仪器研究的热点。《中国药典》2015年版四部“通则2341 农药残留量测定法”推出了“第四法 农药多残留量测定法-质谱法”,同时采用气相色谱-串联质谱法(GC/MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)分别测定74种和153种农药;《中国药典》2020年版“通则0212 药材和饮片检定通则”规定了药材及饮片(植物类)中33种禁用农药(共55个化合物)的定量限,“通则2341 农药残留量测定法”新增“第五法 药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法”,也采用了GC/MS/MS(36个化合物)和LC/MS/MS(30个化合物)测定上述33种禁用农药;《中国药典》2020年版“通则2341 农药残留量测定法”保留了第四法,GC/MS/MS测定的农药数量由74种增加到了88种,LC/MS/MS则由153种大幅提高到了523种。质谱联用技术在《中国药典》中特别是在农药残留方面的应用越来越得到重视,同时也对中药材种植产生了深远影响。2019年11月,农业农村部发布了《禁限用农药名录》,禁用于中药材生产的农药比《中国药典》规定多了31种。随着质谱联用技术近几年硬件和软件上的创新发展,应用质谱联用技术测定农药残留量多年以来都是中药材质量控制的研究热点[29-36]。
3.1气相色谱-质谱联用法(GC-MS)
 
GC-MS是最早得到实现的联用仪(1957年),气相色谱仪可以看作是质谱仪的进样系统,相反也可以把质谱仪看作是气相色谱仪的检测器。由于定性定量能力出色,GC-MS除了在农药残留方面应用广泛,还应用于中药材挥发性成分的分析,是中药材质量控制和未知成分分析的研究重点[37-38]。
3.2液相色谱-质谱联用法(LC-MS)
 
LC-MS在很长一段时间内受制于其离子化接口的技术限制,发展一直落后于GC-MS,直至采用了大气压电离(API)技术之后,才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。LC-MS最常用的有大气压电喷雾电离源(ESI)和大气压化学电离源(APCI),两者同属于API技术,其离子化过程发生在大气压下,这与GC-MS采用在真空下电离的技术有本质不同,其中ESI技术应用更为广泛。在《中国药典》2020年版中LC-MS技术主要用于农药残留量、黄曲霉毒素等真菌毒素、色素、中药材有效成分、生物碱的检测,阿胶、龟甲胶、鹿角胶鉴别,以及药品补充方法中用于中成药的非法添加物质检测。《中国药典》2020年版一部应用单级四极杆液质联用仪测定川楝子、苦楝皮中的川楝素和千里光的阿多尼弗林碱,四部应用串联四极杆液质联用仪测定农药残留量、真菌毒素、色素等。此外,广大药学工作者还报道了大量的LC/MS/MS用于中药材有效成分和有害残留物、中成药有效成分和非法添加化学药、人体生物样本药物浓度等药学领域的测定[39-50],LC-MS技术在药学领域的应用方兴未艾。
4 分子生物学技术
 
分子生物学是在分子水平上对生物研究的一种前沿技术,主要由聚合酶链式反应(PCR)技术、变性梯度凝胶电泳技术、基因芯片技术及现代免疫技术组成。近10年,PCR技术的现代分析生物学在病原微生物鉴别、中药材基原鉴别和真伪鉴别方面[51-59]得到了迅猛发展,从《中国药典》2010年版收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片,以及《中国药典》2010年版第一增补本增加川贝母药材的DNA分子鉴定方法;到《中国药典》2015年版收载了“通则9107 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”,以及《中国药典》2015年版第一增补本增加金钱白花蛇的DNA分子鉴定方法;再到《中国药典》2020年版新收载“通则1001 聚合酶链式反应法”“通则1021 细菌DNA特征序列鉴定法”“通则 3308 禽源性病毒荧光定量PCR(Q-PCR)检查法”“通则9108 DNA测序技术指导原则”,其中新增了霍山石斛的PCR鉴别法。分子生物技术在《中国药典》中的地位越发凸显其重要性,分子生物学技术在药品检验中的应用前景非常广阔。
5 其他现代分析技术
5.1核磁共振波谱法(NMR)
 
NMR是公认的天然有机化合物结构解析中最重要的现代分析技术,与MS、UV、IR一起配合使用,广泛应用于化合物的结构确证,同时可利用分子特定基团的质子数与相应谱峰的峰面积之间的关系进行定量测定。在中药分析领域,可用于成分研究、结构确定、质量评价等[60-64]。
5.2高效毛细管电泳法(HPEC)
 
HPEC为20世纪末逐渐发展形成的一种药物分析技术,具有工作效率较高、分离效果较好等特点,为典型的电泳技术分离方式。HPEC技术自出现以来,便受到人们的广泛重视,尤其是在生命科学、药品以及食品安全领域等实现了快速发展[65-67]。
5.3 X射线荧光光谱法(XRF)
 
XRF是《中国药典》2020年版新收载的技术,可用于药品中元素杂质的控制,其与AAS、ICP-AES、ICP-MS相比具有分析快捷、直观、可靠等优势[68],其测定钯、铜等某些元素的检出限可与ICP-MS相当,但总体检出限与AAS、ICP-MS等仪器相比还是略高一些,在药品检验实验室可与传统的分析仪器形成高低搭配,提高元素测定的效率和降低检测成本。
5.4 离子迁移谱(IMS)
 
IMS是在离子迁移管中利用离子的淌度不同而分离离子,这是其与质谱最大的区别。IMS是国际上公认的快速痕量检测方法,在军事和国际民航中广泛用于爆炸物、化学战剂、毒品、违禁药物等的检测。近年来得益于我国在IMS技术上的进步,IMS技术也逐渐应用于我国药品、食品、保健食品、化妆品的快速筛查中[69-71]。
5.5 电子舌技术
 
电子舌技术应用于传统中药的性状鉴别[72-75],是近几年新兴的一门技术,传统中药往往有复杂的苦味或其他滋味,而且每个人对口尝滋味的感官不一致,很难做到统一的评价。基于电子舌技术可对中药的各种滋味进行客观评价,它不以人的主观感受为评判依据,是中药性状鉴别一个新的技术路线和研究方法。
6 结语
 
综上所述,随着科学技术的迅猛发展,各种检测技术日趋成熟,使现代分析技术有了长足的改进,将在药品检验中发挥重要的作用,相信随着《中国药典》2020年版的实施和各种新技术的引入,将更加拓宽各类现代分析技术在药品质量控制领域中的应用范围,促进我国药品检验技术与国际接轨,同时促使中药现代化在有效成分、作用机制、安全性等方面的深入研究。
 

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