多种高效能氨基酸检测方法在饲料检验中的对比研究
发布时间：2023-03-19作者：小编来源：点击：次
饲料中蛋白质的含量与畜牧业的发展密切相关。将饲料中的蛋白质吸收为动物蛋白，可以大幅提高养殖的生长发育速度。蛋白质是养殖过程中需要摄入的必需营养素，蛋白质可以促进组织的再生和生命的新陈代谢，是构成生物组织细胞膜的重要部分。动物对蛋白质的需求来源于对氨基酸的需求。因而，饲料中含有的氨基酸种类和数量无疑是决定饲料品质的明显标志，对氨基酸的分析方法的研究一直受到高度重视。综上所述，选取合适的方法检验饲料中的氨基酸成分刻不容缓。
目前，社会的发展对动物养殖的安全性提出了更严格的要求，必须掌握饲料中氨基酸和蛋白质的最佳含量，精准提高饲料中蛋白质的转化率，促进动物的养殖速度，降低饲料成本。在常用的动物养殖饲料中，鱼粉含有的氨基酸含量和配比较高，且其氨基酸的种类与养殖动物的氨基酸较为类似，该食品安全性较好，易消化，是动物蛋白的重要来源。所以，此次研究选择鱼粉作为研究对象，用于测量动物饲料含有的氨基酸。
1 实验准备工作
1.1 实验材料
饲料样品（大豆和鱼粉等混合饲料）；苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸等氨基酸18种，浓度均为99%。
1.2 实验药品
乙腈、甲醇、抗坏血酸、冰醋酸、草酸甲酯、苯酚、氯化钠、茚三酮、过氧化氢、2,4-二硝基氯苯、氢氧化锂、硝酸银、乙酸钠、醋酸-醋酸钠混合溶液、苯酚、盐酸、氢氧化钠、甲酸、低速离心机、碳酸氢钠。
1.3 实验设备
剪刀、饲料粉碎机、温控仪、涡旋仪、氨基酸分析仪、天平、电子天平、真空泵、镊子、培养箱、浓缩器、C18色谱柱电烘箱、pH酸度计、高效液相色谱仪、超声波清洗机、万能电烘箱、电加热烘箱、水浴等。
2 氨基酸检测方法
本次氨基酸检测依据GB/T18246-2019《饲料中氨基酸的测定》，该标准规定了饲料中总氨基酸（肽键结合和游离的）和游离氨基酸（天然和添加的）测定方法，包括常规酸水解法、氧化酸水解法、碱水解法和酸提取法。
2.1 微波水解-氨基酸自动分析仪法
实际检测中，微波技术以其响应速度快、能量消耗低、操作较简便等优点逐渐进入人们的视野。采用微波碱解法对样品进行水解，既可以规避常规碱解的缺点，又可以方便地控制碱解过程。具有过程安全、节省时间、容易操作的优点。
2.1.1 样品的处理
选用脂肪低于5%的饲料样品，精确称取0.0100mg～0.0500mg（要求精确到0.0001mg级别），将其放于PTFE消解管中，加入氢氧化钠溶液10mL，然后充入氮气2min。微波水解的碱浓度、水解温度和水解时间选择因子和正交试验条件。
取出PTFE消解管，先将管置于常温冷却30min，然后取出溶液放置于30mL容量瓶中，滴加5mol/L的HCl溶液，中和溶液至中性状态，用水稀释至刻度。
2.1.2 分析统计方法
使用常见的SPSS20.0软件，对实验结果进行分析对比，多重对比时采用Duncan法，将两种方法的结果采用t检验进行比较。当P小于0.01时，认为是显著差异。
2.2 近红外光谱分析法
2.2.1 样品的处理
本实验的所有样品均由食品研磨机研磨，然后混合并储存在4℃的环境下保持。对于鱼粉饲料样品，进行脱脂、干燥、粉碎，然后冷藏备用。
2.2.2 饲料中氨基酸的检测
往饲料鱼粉的样品中添加一定量的蛋白质裂解液，制作氨基酸标准溶液[7]。将氨基酸标准溶液置于氨基酸分析仪，梯度洗脱法把各种氨基酸洗脱于溶液中，同时设置一组氨基酸标准溶液进行空白对照，利用湿法化学对所有样品鱼粉中的氨基酸进行检测。
2.2.3 样品数据的验证
实验中近红外光谱仪扫描分析鱼粉样品，通过对数据进行推测，对比以往的数据，根据t检验方法，从而验证数据的科学性。
2.3 高效液相色谱法
2.3.1 样品溶液的配制
称量少许的动物饲料样品中常见的18种氨基酸的标准样品，保证其中氨基酸含量控制在60mg～80mg，放入250mL容量瓶中，使用0.1mol/L盐酸定容，摇匀溶解样品或将样品均匀分散在溶液中，得到1000mg/L20种氨基酸混合标准液，充入氮气，喷灯密封，然后放置烘箱（110±1）℃水解24h，室温环境下冷却至常温。使用试管准确量取5mL该混合溶液，使用浓缩器对该试管浓缩处理，加入稀盐酸水解，取出上层清液保存在冰箱中供实验备用。
2.3.2 高效液相色谱的调节条件
条件设置为C18型色谱柱，A相为CH3OH溶液；B相为乙酸混合溶液，控制流动相的速度为1.5mol/min；进样量10μL，设定柱温32℃，选用紫外光的波长290nm，等度洗脱，流动A相:流动B相=1:8。
2.3.3 饲料样品曲线的制备
分别选取浓度为25mg/L、50mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、350mg/L、450mg/L、550mg/L、650mg/L的氨基酸溶液各100μL的混合溶液，注入有机塑料膜处理，控制进液量为5μL，通过软件测试。以盐酸浓度为横坐标，以氨基酸的峰面积值为纵坐标，作出鱼粉饲料的相关氨基酸图像。
3 实验结果与分析
3.1 不同检验方法下的水解条件对比
为研究分析不同检测方法对饲料中含有的氨基酸水解时间的影响，选取鱼粉和豆粕等测试样品进行预测试，按照定义的方法测试食品样品的氨基酸水解方法。
饲料氨基酸样品的微波水解处理温度为160℃，设定处理的时间为30min。采用高效液相色谱法测定时，设定水解的温度控制在140℃，时间为15min时，鱼粉水解氨基酸的结果值与正常条件下的胺值较为接近；采用近红外光谱分析法测定时，设置水解的温度170℃，设置处理时间在27min，鱼粉中水解氨基酸值远高于标准水解条件。综合比较三种方法下饲料鱼粉的氨基酸水解条件，认为高效液相色谱法处理时，氨基酸的水解时间最小，温度处理的时间也最短，水解效果也最好。
3.2 不同检验方法对氨基酸峰面积的影响
将饲料样品加入3mol/L、5mol/L、7mol/L、9mol/L、11mol/L不同浓度梯度的盐酸溶液中，放入水浴中进行水解，取上清液过滤，送入氨基酸分析或高效液相色谱法确定氨基酸的种类，以峰面积为指标，确定盐酸的最佳浓度。
如图1至图3所示，在各个氨基酸样品放入不同浓度的盐酸溶液，来检验各个氨基酸面积峰值。通过实验曲线可以看出，随着盐酸的浓度从3mol/L增至7mol/L，氨基酸峰面积随着盐酸浓度的增加呈上升趋势。随后盐酸浓度逐渐增高，氨基酸峰面积逐渐减小。根据三种实验图像曲线可以看出，使用高效液相色谱法测量的一组，结果氨基酸峰面积值较高，且检测效果更好；而使用近红外光谱分析法测量的一组，结果氨基酸峰面积值很少，检测效果也相对更差。
图1 微波水解-氨基酸自动分析仪法测量时的氨基酸峰面积
图2 高效液相色谱分析法测量时的氨基酸峰面积
图3 近红外光谱分析法测量时的氨基酸峰面积
3.3 不同分析方法对饲料氨基酸测定结果的影响
如表1所示，采用微波水解-氨基酸自动分析仪法时，检测结果中饲料中氨基酸组成成分与实际组成结果差距很大，各种氨基酸相似度的偏差范围在2.5%到6.5%之间不等；采用近红外光谱分析法时，检测结果中饲料中氨基酸成分和含量与实际组成较为相似，各种氨基酸相似度的偏离范围约为0.22%到1.25%之间；采用高效液相色谱分析法检验时，检测结果中饲料中氨基酸成分和含量与实际基本相同，各种氨基酸相似度的偏差范围控制在0.02%～0.1%之间。根据实验检测方法对氨基酸结果的影响，发现高效液相色谱法进行检验时，饲料鱼粉中的氨基酸与实际情况基本相同，检验效果最小。
表1 不同分析方法对饲料氨基酸的组成影响（单位：mol/L)
3.4 不同检验方法对氨基酸稳定性的影响
如表2所示，采用微波水解-氨基酸自动分析仪法时，检测结果中饲料中氨基酸稳定性与实际情况差距很大，各种氨基酸相似度的偏差范围在1.52%到5.55%之间不等；采用近红外光谱分析法时，检测结果中饲料中氨基酸稳定性与实际情况差距相对较小，各种氨基酸相似度的偏差范围在0.25%到0.86%之间；采用高效液相色谱分析法检验时，检测结果鱼粉饲料稳定性与实际情况基本相同，氨基酸的偏离范围控制在0.02%～0.11%之间。根据实验检测方法对氨基酸稳定性结果的影响，认为采用高效液相色谱法检验时，饲料鱼粉中的氨基酸与实际结果基本相同，对氨基酸稳定性影响最弱，结果偏差最小。
3.5 不同检验方法对氨基酸含量的影响
采用微波水解-氨基酸自动分析仪法时，检测结果中氨基酸的检验值大于实际正常值，各种氨基酸的变异系数较大；采用近红外光谱分析法时，检测结果中饲料中氨基酸的测量值略高于实际标准值，各种氨基酸的标准差在0.15%～0.25%之间；采用高效液相色谱法时，检测结果中饲料中氨基酸的测量值与实际标准值基本相似，各种氨基酸的标准差和变异系数最小。
表2 不同分析方法对氨基酸稳定性的影响（单位：mol/L)
综合分析实验结果表明，三种测定方法检验达到了检测饲料中氨基酸含量和组分的标准。
4 结论
(1）本次研究通过开展实验，采用了微波水解-氨基酸自动分析仪法、近红外光谱分析法和高效液相色谱法等三种检测方法对饲料中氨基酸的含量和组分进行了测量。
(2）通过对比不同检测方法下水解条件、氨基酸峰面积、氨基酸测量结果、氨基酸的稳定性等，对三种方法的优劣势进行了分析。
(3）综合分析实验结果，三种测定方法都满足实际需求，但高效液相色谱法具有操作方便、检测准确度高、检测效率高等优点，适用于动物饲料中氨基酸含量的批量检测。
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