油料在生长、储藏、加工各环节都会有香料的产生和迁移。香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪均具有修饰和增香功能，已被广泛应用于现代食品工业中。研究表明，摄入大剂量的香精香料会伤害人体肝脏组织细胞。目前，GB 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》中明确规定食用植物油脂中不得添加各类香精香料。然而，一些不法商贩为获取高额利润，仍在低价的食用油中加入香精，勾兑后以高价油进行销售,并以“内源性香料”为借口逃避监管处罚。在食用植物油中存在内源性香料，可能来源于油料作物或油脂加工过程中。因此，为了甄别食用油中香精香料的真实来源，同时基于日常监管需要，建立油料作物中香精香料的检测方法迫在眉睫。

目前，对于油料作物中香精香料的含量水平和检测的相关信息较少，主要集中在婴幼儿配方产品、食用油、糕点、糖果、饮料等基质中。香精香料的前处理提取技术主要有固相萃取法、蒸馏萃取法、静态顶空法等分析方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、电化学法等,但这些方法能同时检测香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪这5种香精香料的较少。为更好地检测油料中香精香料的含量，本试验采用固相萃取-气相色谱法，建立一种同时测定油料作物中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪的检测方法，为食用油的品质评判和溯源香料来源提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

乙基麦芽酚、香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、2,3,5-三甲基吡嗪标准品(纯度均大于99. 6 %),上海安谱科学仪器有限公司；试验用水，一级纯水；甲醇、正己烷、乙腈、二氯甲烷，色谱纯；氯化钠，化学纯；油菜籽、芝麻、花生，市售；C18固相萃取柱、0.22 μm 微孔滤膜，上海安谱科学仪器有限公司。

1.2仪器与设备

气相色谱仪(配FID检测器),；ME204分析天平，；Milli-Q超纯水器；Allegra X-15R冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；SK8200LHC超声波清洗器，；VXMNAL涡旋振荡器，奥豪斯仪器(常州)有限公司；毛细管色谱柱(HP-1、HP-5、HP-1701、CD-WAX、DB-624),美国Agilent公司。

1.3试验方法

1.3.1样品前处理

称取2.00 g已粉碎(过 0.60 mm筛)的油料，加入5 mL 水，涡旋振荡 1 min, 加入20 mL乙腈，涡旋振荡2 min, 以100 kHz, 20 ℃超声提取30 min后，加入3 g氯化钠，涡旋振荡30 s, 加入3 mL正己烷，涡旋振荡1 min, 在5 ℃条件下以 4 000 r/min离心10 min, 取10 mL中间液至试管中，于40 ℃氮吹至近干，加入1 mL甲醇溶解残渣，用水定容至10 mL,使该样液以小于1 mL/min的流速通过C18固相萃取柱。当样液全部流出后，用5 mL水淋洗，负压抽干，10 mL 甲醇-水溶液(体积比4 ∶1)洗脱，负压抽干，收集洗脱液，再于40 ℃氮吹至近干，准确加入1 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm 微孔滤膜后，取1 μL滤液进行气相色谱分析。

1.3.2标准溶液的制备

1.3.2.1标准储备溶液和标准中间溶液

称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪各20 mg(精确至0.1 mg),分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀，配制质量浓度2 000 mg/L的标准储备溶液，并转移至棕色玻璃容器内于-18℃下避光保存。

吸取上述标准储备溶液各5 mL,分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀，配制质量浓度1000 mg/L的标准中间溶液。

1.3.2.2标准系列工作溶液

分别吸取标准中间液0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000、2.000 mL,置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液定容，混匀，得到质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 mg/L的标准系列工作溶液。

1.3.2.3仪器条件

CD-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);进样口温度 270 ℃; 采用程序升温，初始温度 90 ℃,保持 3 min, 以 10 ℃/min 升温至 220 ℃, 保持3 min, 再以 20 ℃/min 升温至240 ℃,保持3 min; 检测器温度280 ℃; 不分流进样，流量2.0 mL/min, 进样量1 μL;载气，氮气；氢气流量400 mL/min; 空气流量40 mL/min; 氮气流量25 mL/min。

2 结果与分析

2.1色谱柱的优化

甲基香兰素和乙基香兰素为同分异构体，香兰素的沸点、极性、相对分子质量与甲基香兰素和乙基香兰素接近，在气相色谱上同时检测很难将这3种化合物分离。因此比较了HP-1、HP-5、HP-1701、CD-WAX、DB-624这5种不同固定相键合的毛细管色谱柱对5种香精香料的分离效果。结果表明：HP-1、HP-5毛细管色谱柱在分离过程中存在拖尾现象，且分离度不彻底；而用DB-624毛细管色谱柱分析的香料出峰时间较晚。用CD-WAX毛细管色谱柱分析，5种香精香料分离效果好，且无干扰。故本试验选用 CD-WAX 毛细管色谱柱。

2.2提取条件的优化

2.2.1提取溶剂的优化

比较了正己烷、乙腈、二氯甲烷和甲醇对5种香精香料的提取效果。由图1可知：二氯甲烷和乙腈对这5种香精香料的提取效率均较高，其中乙腈作为提取液，其带出的油脂杂质较少，离心后分层效果更好，上清液更加清澈，这为下一步固相萃取柱处理提供了便利。

由于油料样品富含脂肪和纤维类物质，还有大量蛋白质，提取的溶液也会含有一定的脂质，直接用乙腈提取存在分散不完全的现象[12]。为了提高乙腈的提取效率，在提取过程中加入一定量的水可以使颗粒在液体中均匀分布，维持分散状态。因此，采用不同体积比的乙腈和水对5种香精香料(添加量均为1.5 mg/kg)油料样品进行提取，并对比回收率。由图2可知：当乙腈和水体积比为20 ∶3时，5种香精香料的提取效率均最高。因此，选择乙腈和水体积比20 ∶3的溶液作为提取溶剂。

2.2.2提取时间的优化

在不同超声提取时间下对5种香精香料添加量均为1.5 mg/kg的油料样品进行提取，并对比回收率。由图3可知：随着提取时间的延长，5种香精香料的回收率都增加，当超声提取时间为20 min时，乙基麦芽粉、香兰素、甲基香兰素、2,3,5-三甲基吡嗪回收率达到最大，乙基香兰素也达到较高的回收率，再增加提取时间，有2种化合物回收率开始下降。因此，选择提取时间为20 min。

2.2.3固相萃取条件的优化

采用不同的固相萃取柱对5种香精香料(添加量均为1.5 mg/kg)油料样品进行处理，并对比回收率。由图4可知：使用C18固相萃取柱对5种香精香料的回收率最高，这是因为C18固相萃取柱键合的固定相具有非极性、未封端的特性，柱子的吸附剂让油脂相更易通过[16]。此外，与相应的封端吸附剂相比，C18固相萃取柱对碱性化合物的保留效果更好，能够使香精香料更好地保留在萃取柱上，提高了前处理的净化效果[17]。因此，选择C18固相萃取柱作为本试验的净化材料。

2.3方法评价

2.3.1线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

将标准混合系列工作液分别注入气相色谱中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中香精香料的质量浓度为横坐标，以香精香料的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5种香精香料在0.5～200.0 mg/L线性范围内，相关系数均大于0.999,呈现良好的线性关系。LOD和LOQ的计算分别基于信噪比的3倍和10倍。5种香精香料的LOD和LOQ分别为0.5 mg/kg和1.5 mg/kg, 回归方程相关系数，保留时间见表1。

2.3.2回收率与相对标准偏差(RSD)

通过分析加标油料(花生、芝麻和油菜籽)样品的回收率，验证方法的重复性。由表2可知：香兰素的回收率为95.2 %～98.9 %,RSD为1.45 %～4.48 %;甲基香兰素的回收率为95.5 %～98.9 %,RSD为1.76 %～4.54 %;乙基香兰素的回收率为95.9 %～102.7 %,RSD为1.24 %～4.39 %;乙基麦芽酚的回收率为96.7 %～104.2 %,RSD为1.25 %～4.11 %;2,3,5-三甲基吡嗪的回收率为96.3 %～101.5 %,RSD为1.35 %～3.04 %。经验证，该方法满足油料中香精香料的检测要求。

2.3.3 实际样品分析

采用建立的固相萃取净化结合气相色谱法分析测定15个不同油料样品中的5种香精香料。由表3可知：在15个不同油料样品中，6个样品检出香兰素，其含量为0.52～1.77 mg/kg, 检出率为40 %;其他4种香精香料未检出。从油料种类来看，在油菜籽样品中有1个样品检出芝麻中香兰素，花生样品未检出。

3 结论

本研究建立一种通过固相萃取-气相色谱法同时测定油料中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、乙基麦芽酚和2,3,5-三甲基吡嗪的方法。采用固相萃取柱C18为净化材料，以乙腈和水体积比20 ∶3为提取溶剂，经超声提取时间20 min后采用CD-WAX毛细管色谱柱进行样品分析。结果表明：建立的方法在0.5～200.0 mg/L范围内线性关系良好，回收率为95.2 %～104.2 %,RSD为1.24 %～4.54 %。5种香精香料的检出限和定量限分别均为0.5 mg/kg和1.5 mg/kg。将方法用于测定15个油料样品，有6个样品检出香兰素。本研究为菜籽油、芝麻油及花生油中香料来源的监管提供理论依据。